Новые методы определения чувствительности бактерий к химиопрепаратам. Автоматические системы учёта результатов метода серийных разведений. Е-тест.
В настоящее время разработаны компьютеризованные системы , автоматически проводящие выделение бактерий из исследуемых образцов и определяющие их чувствительность к различным ЛС. Их основное достоинство - освобождение персонала бактериологических лабораторий от большого объёма рутинных исследований и чёткая стандартизация полученных результатов.
Широкое распространение этих устройств в отечественной практике ограничивает их стоимость. Среди более доступных методов наибольшее распространение нашли система Alamar и Е-тест , совмещающие в себе достоинства метода серийных разведений и метода дисков.
Новые методы определения чувствительности бактерий к химиопрепаратам. Автоматические системы учёта результатов метода серийных разведений">
Автоматические системы учёта результатов метода серийных разведений (например, Baxter MicroScan AutoSCAN-4) - автоматизированные инкубационные системы со встроенными фотометрами, нефелометрически регистрирующими рост бактерий или его отсутствие через 24 ч после внесения микроорганизмов в лунки микропанелей. Принцип действия основан на учете разницы оптической плотности среды в лунках, где есть рост бактерий, и в лунках, где его нет. В настоящее время разработаны устройства (например, VITEK), позволяющие получить результаты уже через 4-10 ч.
Система Alamar представляет собой панель с лунками, в каждую помещены диски из фильтровальной бумаги, содержащие различные концентрации антимикробных препаратов и пропитанные индикатором Alamar Blue. После внесения в лунку бактерий диск синеет, а при их дальнейшем росте его окраска меняется на розовую. Порядок размещения дисков в лунках соответствует двойным серийным разведениям препарата. Последняя лунка с синим диском, предшествующая лункам с порозовевшими дисками, соответствует МИК препарата.
Е-тест [от англ. ellipse, эллипс, так как при наличии чувствительности образуется зона задержки роста эллиптической формы] - модификация метода дисков, но вместо последних используют полоски из фильтровальной бумаги, пропитанной различными концентрациями препаратов, каждая из этих зон имеет соответствующую маркировку. Полоски помещают на поверхность агара. Если бактерии чувствительны к действию препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, образуется эллипсовидная зона. Её форма обусловлена действием сразу нескольких концентраций препарата. МИК соответствует участок полоски, где её пересекает граница зоны задержки роста.
В этой части мы рассмотрим сквозное (E2E) тестирование: протестируем всё приложение целиком, причём сделаем это с точки зрения пользователя, по сути, автоматизируя все его действия.
В нашем случае приложение состоит только из фронтенда - бэкенда попросту нет, поэтому E2E-тестирование будет заключаться в открытии приложения в реальном браузере, выполнении набора вычислений и проверке валидности значения на экране.
Нужно ли проверять все перестановки, как мы делали это в юнит-тестах? Нет, ведь это уже проверено! В E2E-тестах мы проверяем работоспособность не отдельных юнитов, а всей системы сразу.
Сколько нужно E2E-тестов?
Первая причина, по которой таких тестов не должно быть много, - хорошо написанных интеграционных и юнит-тестов должно хватить. E2E-тесты должны проверить, что все элементы корректно связаны между собой.
Вторая причина - они медленные. Если их будет сотня, как юнит-тестов и интеграционных, то тестирование будет проходить очень долго.
Третья причина - непредсказуемое поведение E2E-тестов. О таком явлении есть пост в блоге Google, посвященном тестированию. В юнит-тестах не наблюдается такого нестабильного поведения. Они могут то проходить, то падать - причем без видимых изменений, исключительно из-за I/O. Можно ли убрать непредсказуемость? Нет, но можно свести её к минимуму.
Чтобы избавиться от непредсказуемости, делайте как можно меньше E2E-тестов. Пишите один E2E-тест на десять других, и лишь тогда, когда они действительно необходимы.
Пишем E2E-тесты
Перейдём к написанию E2E-тестов. Нам нужны две вещи: браузер и сервер для нашего фронтенд-кода.
Сперва взглянем на настройку веб-сервера.
Настройка веб-сервера в Mocha
Веб-сервер на Node? На ум сразу же приходит express , давайте посмотрим код:
Let server before((done) => { const app = express() app.use("/", express.static(path.resolve(__dirname, "../../dist"))) server = app.listen(8080, done) }) after(() => { server.close() })
В функции before мы создаем express-приложение, указываем ему папку dist и прописываем слушать порт 8080. В функции after мы «убиваем» сервер.
Папка dist - это то место, где мы храним наши JS-скрипты и куда копируем HTML- и CSS-файлы. Вы можете увидеть, что мы делаем это в сборочном скрипте npm в package.json:
{ "name": "frontend-testing", "scripts": { "build": "webpack && cp public/* dist", "test": "mocha "test/**/test-*.js" && eslint test lib", ... },
Это значит, что для E2E-тестов нужно сначала выполнить npm run build , а потом npm test . Да, это неудобно. В случае юнит-тестов этого делать не нужно, так как они запускаются под Node и не требуют трансляции и сборки.
Для полноты картины давайте взглянем на webpack.config.js , где описано, как Webpack должен делать сборку файлов:
Module.exports = { entry: "./lib/app.js", output: { filename: "bundle.js", path: path.resolve(__dirname, "dist") }, ... }
Папка dist используется как в пользовательском окружении, так и в E2E-тестах. Это важно - запускать E2E-тесты нужно в средах, максимально похожих на «боевые».
Настройка браузера в Mocha
Наше приложение установлено на сервер - осталось лишь запустить для него браузер. Какую библиотеку мы будем использовать для автоматизации? Я обычно использую популярную selenium-webdriver .
Для начала давайте посмотрим, как мы используем её, прежде чем начнём разбираться с настройками:
Const {prepareDriver, cleanupDriver} = require("../utils/browser-automation") //... describe("calculator app", function () { let driver ... before(async () => { driver = await prepareDriver() }) after(() => cleanupDriver(driver)) it("should work", async function () { await driver.get("http://localhost:8080") //... }) })
В функции before мы готовим драйвер, а в after - очищаем его. Подготовка драйвера будет запускать браузер, а очистка - закрывать его. Заметим, что настройка драйвера происходит асинхронно и мы можем использовать async/await , чтобы сделать код красивее.
В тестовой функции мы открываем адрес http://localhost:8080 , снова используя await , учитывая, что driver.get - асинхронная функция.
Так как же выглядят prepareDriver и cleanupDriver ?
Const webdriver = require("selenium-webdriver") const chromeDriver = require("chromedriver") const path = require("path") const chromeDriverPathAddition = `:${path.dirname(chromeDriver.path)}` exports.prepareDriver = async () => { process.on("beforeExit", () => this.browser && this.browser.quit()) process.env.PATH += chromeDriverPathAddition return await new webdriver.Builder() .disableEnvironmentOverrides() .forBrowser("chrome") .setLoggingPrefs({browser: "ALL", driver: "ALL"}) .build() } exports.cleanupDriver = async (driver) => { if (driver) { driver.quit() } process.env.PATH = process.env.PATH.replace(chromeDriverPathAddition, "") }
Это сложная штука. И я должен кое-что признать: этот код был написан кровью (о, и он работает только в Unix-системах). Он был написан при помощи Google, Stack Overflow и документации webdriver и сильно модифицирован методом научного тыка. Но он работает!
Теоретически вы можете просто скопипастить код в свои тесты, не разбираясь в нём, но давайте заглянем в него на секунду.
Первые две строки подключают webdriver - драйвер для браузера. Принцип работы Selenium Webdriver заключается в наличии API (в модуле selenium-webdriver , который мы импортируем в строке 1), который работает с любым браузером, и он полагается на драйверы браузера, чтобы… управлять различными браузерами. Драйвер, который я использовал, - chromedriver , импортированный в строке 2.
Драйвер Chrome не нуждается в браузере на машине: он фактически устанавливает свой собственный исполняемый файл Chrome, когда вы выполняете npm install . К сожалению, по некоторым причинам, которые я не могу понять, он не может найти его, и каталог chromedriver должен быть добавлен в PATH (это именно то, что не работает в Windows). Это мы делаем в строке 9. Мы также удаляем его из PATH на этапе очистки, в строке 22.
Итак, мы настроили драйвер браузера. Теперь пришло время настроить (и вернуть) веб-драйвер, что мы и делаем в строках 11–15. А поскольку функция build асинхронна и возвращает , мы ждём её при помощи await .
Почему мы делаем это в строках 11–15? Причины скрыты туманом опыта. Не стесняйтесь копипастить - никаких гарантий не прилагается, но я использовал этот код некоторое время, и проблем не возникало.
Приступим к тестам
Мы закончили настройку - пришло время взглянуть на код, который использует webdriver для управления браузером и тестирования нашего кода.
Идея челночного бега разработана датчанином Йенгсом Бенгсбо и состоит из интенсивной интервальной физической нагрузки (интервальный тест на выносливость, ключевое слово «интенсивной») и способности восстанавливаться после её выполнения (интервальный тест восстановления, опять же после интенсивной физической нагрузки), а при снятии показаний ЧСС еще и определять индивидуальные особенности организма спортсмена в аэробном (в большей степени) и анаэробном режиме.
Йо-Йо тест:
Фишками обозначают три линии (см.фото). 5 метров для восстановления и 20 метров для бега. Тест включает в себя бег между фишек, расположенных на удалении 20 метров друг от друга, туда и обратно. Старт по команде. Время между сигналами, т.е время для прохождения 40 метрового отрезка постепенно сокращается в зависимости от уровня. Время между отдыхом и основным бегом составляет 5 или 10 секунд в зависимости от разновидности Йо-йо теста. Спортсмен начинает тест с маленького уровня, где поочередно с отдыхом проходит отрезки за определенное время. Потом наступает следующий уровень, где количество отрезков на уровне увеличивается, а время прохождения отрезка в 40 метров уменьшается и повышается скорость бега. Т.е спортсмены неоднократно, без остановки выполняют рывки с восстановлением, и с повышением уровня. Время, положенное для прохождения отрезка уменьшается. Игрок сходит с Йо-йо теста, когда он уже не будет успевать проходить отрезки за положенное время. Концом Йо-йо теста является общее расстояние, которое спортсмен пробежал до схода с дистанции.
Отлично: Скорость 19 - 20 км/ч Дистанция: > 2320 м. Кол-во сорокаметровых отрезков: >58
Очень хорошо: Скорость 18-19 км/ч Дистанция: >2000 м. Кол-во сорокаметровых отрезков: >50
Хорошо: Скорость 17-18 км/ч Дистанция: >1680 м. Кол-во сорокаметровых отрезков: >42
Плохо: Скорость 16-17 км/ч Дистанция: >1360 м. Кол-во сорокаметровых отрезков: >34
Очень плохо: Скорость 15-16 км/ч Дистанция: >1040 м. Кол-во сорокаметровых отрезков: >26
Идея тестирования нивелируется или, можно сказать, дискредитируется нежеланием футболистов его проходить или формальным подходом к участию в нем. Основная масса игроков проходит 40-метровые отрезки так и не выходя на максимальное значение ЧСС, а когда наступает порог, при пересечении которого необходимо прикладывать усилия, они просто сходят с дистанции. Считают, что лишний раз напрягаться не имеет смысла: «Ко мне какие претензии, я пробежал».
Особенно таким умозаключениям подвержены опытные футболисты. Поэтому 75 % результатов Йо-Йо теста после проведения в российских командах можно выбрасывать в мусорную корзину, поскольку они не несут никакой информативности, а даже наоборот сбивают с толку своими результатами и уводят тренерский состав и врачей команд не в том направлении относительно функциональной готовности игроков команды.
Последние Новости о спортивной медицине.
Курсы повышения квалификации по программе «Спортивная психология». Июнь 2019 год.
АНО ДПО "Национальный институт биомедицины и спорта"
97Новый футбольный клуб ищет врача команды. Срочно.
Сезон стартует через 10 дней 770Новости о спортивной медицине, интересные вам:
Определены ключевые факторы успеха на Чемпионате мира по регби
Проведя ряд исследований, британские спортивные врачи пришли к выводу, что залогом успеха команд по регби на Чемпионате мира с 1987 по 2007 г. являлись антропометрические показатели игроков, а именно 1535
Etest® представляет собой полоску из инертного пластика, на которую нанесен антимикробный препарат в концентрации, изменяющейся по градиенту от минимальной до максимальной, в диапазоне, эквивалентном 15 двукратным разведениям. С другой стороны на полоску нанесена шкала соответствующих минимальных ингибирующих концентраций (МИК). Е-тесты позволяют определять минимальную ингибирующую концентрацию антимикробного препарата (количественный диффузионный метод).
. Засейте чашку культурой микроорганизма.
. Разместите полоски Etest® (до 2 на стандартную чашку диаметром 90 мм, или до 6 на чашку диаметром 180 мм).
. В процессе культивирования вокруг полоски сформируется эллипсовидная зона ингибирования роста, которая пересекает стрип в точке, соответствующей МИК.
. Е-тесты используются более 20 лет.
. Более 100 антимикробных препаратов.
. Стрипы для выявления полирезистентности.
. Определение чувствительности прихотливых микроорганизмов, стрептококков, анаэробных микроорганизмов, грибов (в т.ч. плесневых), микобактерий туберкулеза и пр.
. Удобная форма выпуска: по 30 или 100 штук, в блистерной упаковке или пенопластовом картридже.
| Номер по каталогу | |||||
| Индивидуальная упаковка |
Пенопластовый картридж (t° хранения +20°С / +4°С) |
(t° хранения -20°С) |
|||
| Наименование | 30 стрипов | 100 стрипов | 30 стрипов | 100 стрипов | 30 стрипов |
| Противогрибковые | |||||
| E-тест Амфотерицин | 526318 | 526310 | |||
| E-тест Анидулафунгин | 532008 | 532000 | |||
| E-тест Вориконазол | 532818 | 532810 | |||
| E-тест Итраконазол | 412380 | 525818 | 525810 | ||
| E-тест Каспофунгин | 412269 | 532418 | 532410 | ||
| E-тест Кетоконазол | 525918 | 525910 | |||
| E-тест Микафунгин | 535708 | 535700 | |||
| E-тест Позаконазол | 532118 | 532110 | |||
| E-тест Флюконазол | 412350 | 510818 | 510810 | ||
| E-тест Флюцитозин | 510918 | 510910 | |||
| Противотуберкулезные | |||||
| E-тест Изониазид | 527900 | ||||
| E-тест Этамбутол | 527700 | ||||
| E-тест Этионамид | 527500 | ||||
| Противобактериальные | |||||
| E-тест Азитромицин | 412251 | 501618 | |||
| E-тест Азтреонам | 412259 | 501718 | 501710 | ||
| E-тест Амикацин | 412219 | 501318 | |||
| E-тест Амоксициллин | 412243 | 500918 | |||
| E-тест Амоксициллин / клавулановая кислота (2/1) | 412241 | 501018 | 501010 | ||
| Е-тест Ампициллин | 412253 | 501518 | |||
| E-тест Ампициллин/сульбактам (2/1) | 412251* | 501818 | 501810 | ||
| E-тест Бацитрацин | 528608 | 528600 | |||
| E-тест Бензилпенициллин (высокая концентрация) | 412263 | 502518 | |||
| E-тест Бензилпенициллин (низкая концентрация) | 412265 | 502618 | |||
| E-тест Ванкомицин | 412488 | 525518 | |||
| E-тест Гатифлоксацин | 530218 | 530210 | |||
| E-тест Гентамицин (высокая концентрация) | 512708 | 512700 | |||
| E-тест Гентамицин (низкая концентрация) | 412368 | 512518 | |||
| E-тест Даптомицин | 412324 | 535018 | 535010 | ||
| E-тест Доксициклин | 412328*** | 509718 | 509710 | ||
| E-тест Дорипенем | 412326*** | 535918 | 535910 | ||
| E-тест Имипенем | 412374 | 513618 | |||
| E-тест Канамицин | 527818 | 527810 | |||
| E-тест Кларитромицин | 508718 | 508710 | |||
| E-тест Клиндамицин | 412315 | 509518 | |||
| E-тест Колистин | 412317** | 537308 | 537300 | ||
| E-тест Левофлоксацин | 412393 | 527418 | |||
| E-тест Линезолид | 412396 | 531318 | |||
| E-тест Меропенем | 412402 | 513818 | |||
| E-тест Метронидазол | 412404 | 530018 | |||
| E-тест Мециллинам | 513708 | 513700 | |||
| E-тест Миноциклин | 412409*** | 516018 | 516010 | ||
| E-тест Моксифлоксацин | 412411** | 529018 | 529010 | ||
| E-тест Мупироцин | 412417*** | 413496 | 516300 | ||
| E-тест Налидиксовая кислота | 516508 | 516500 | |||
| E-тест Нетилмицин | 517518 | 517510 | |||
| E-тест Нитрофурантоин | 412426*** | 530408 | 530400 | ||
| E-тест Норфлоклацин | 412428** | 519508 | 519500 | ||
| E-тест Оксациллин | 412432 | 520518 | |||
| E-тест Офлоксацин | 519618 | 519610 | |||
| E-тест Пиперациллин | 521518 | 521510 | |||
| E-тест Пиперациллин/тазобактам (4мкг/мл) | 412434 | 521418 | |||
| E-тест Полимиксин | 533408 | 533400 | |||
| E-тест Рифампицин | 412450 | 526018 | 526010 | ||
| E-тест Спектиномицин | 529218 | 529210 | |||
| E-тест Стрептомицин | 412454 | 526808 | 526800 | ||
| E-тест Сульфаметоксазол | 534118 | 534110 | |||
| E-тест Тейкопланин | 412461 | 522018 | |||
| E-тест Тетрациклин | 412471 | 522518 | |||
| E-тест Тайгециклин | 412475 | 533518 | |||
| E-тест Тикарциллин/клавулановая кислота | 522618 | 522610 | |||
| E-тест Тобрамицин (высокая концентрация) | 533108 | 533100 | |||
| E-тест Тобрамицин (низкая концентрация) | 522718 | 522710 | |||
| E-тест Триметоприм | 523618 | 523610 | |||
| E-тест Триметоприм/сульфаметоксазол (1/16) | 412481 | 524418 | |||
| E-тест Фосфомицин | 529108 | 529100 | |||
| E-тест Фузидиева кислота | 511518 | 511510 | |||
| E-тест Хинупристин/дальфопристин | 528718 | 528710 | |||
| E-тест Хлорамфеникол | 412309 | 507518 | 507510 | ||
| E-тест Цефаклор | 504518 | 504510 | |||
| E-тест Цефалотин | 412307 | 503518 | 503510 | ||
| E-тест Цефепим | 412273 | 505018 | 505010 | ||
| E-тест Цефиксим | 412275 | 529918 | 529910 | ||
| E-тест Цефокситин | 412285 | 506518 | 506510 | ||
| E-тест Цефоперазон/сульбактам (2/1) | 529318 | 529310 | |||
| E-тест Цефотаксим (высокая концентрация) | 412279 | 505518 | |||
| E-тест Цефотаксим (низкая концентрация) | 412281 | 505618 | |||
| E-тест Цефотетан | 506308 | 506300 | |||
| E-тест Цефпиром | 506408 | 506400 | |||
| E-тест Цефподоксим | 505818 | 505810 | |||
| E-тест Цефтазидим | 412293 | 506718 | |||
| E-тест Цефтаролин | 412291 | ||||
| E-тест Цефтизоксим | 527308 | 527300 | |||
| E-тест Цефтобипрол | 412297 | ||||
| E-тест Цефтриаксон (высокая концентрация) | 412301 | 506618 | 506700 | ||
| E-тест Цефтриаксон (низкая концентрация) | 412303 | 507018 | 507000 | ||
| E-тест Цефуроксим | 506918 | 506910 | |||
| E-тест Ципрофлоксацин | 412311 | 508618 | |||
| E-тест Энрофлоксацин | 528908 | 528900 | |||
| E-тест Эритромицин | 412334 | 510518 | |||
| E-тест Эртапенем | 412332 | 531618 | 531610 | ||
| Номер по каталогу |
|||
| Индивидуальная упаковка |
Пластиковая секционная упаковка (t° хранения -20°С) |
||
| Наименование | 30 стрипов | 100 стрипов | 30 стрипов |
| Определение полирезистентности | |||
| E-тест Цефотаксим / Цефотаксим + клавулановая кислота (4 мкг/мл) |
412336** | 532208 | 532200 |
| E-тест Цефтазидим / Цефтазидим + клавулановая кислота (4 мкг/мл) Предназначен для определения наличия ферментов бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), ингибируемых клавулановой кислотой, у грамотрицательных бактерий, в том числе Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, других представителей семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa |
412340** | 532508 | 532500 |
| E-тест Цефепим / Цефепим + клавулановая кислота (4 мкг/мл) Предназначен для определения наличия ферментов бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), ингибируемых клавулановой кислотой, у грамотрицательных бактерий, в том числе Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, других представителей семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa |
412338** | 534708 | 534700 |
| E-тест Имипенем / Имипенем + ЭДТА Предназначен для определения наличия ферментов металло-бета-лактамаз у грамотрицательных бактерий, в том числе Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. | 534208 | 534200 | |
| E-тест Ванкомицин / Тейкопланин Предназначен для определения устойчивости (или умеренной устойчивости) к гликопептидам грамположительных бактерий, в том числе Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. |
537208 | 537200 | |
| E-тест Цефотетан / Цефотетан + клаксациллин Предназначен для определения наличия ферментов AmpC-бета-лактамаз у грамотрицательных бактерий |
537108 | 537100 | |
Диско-диффузионный метод
На поверхность плотной питательной среды, засеянной сплошным газоном исследуемой культурой, накладывают не более 6 дисков, пропитанных антибиотиками, на расстоянии не менее 2 см друг от друга. Регистрация результатов проводится через 18-24 часов инкубирования в термостате по диаметру зоны отсутствия роста вокруг дисков с антибиотиками. Наличие роста вокруг диска свидетельствует о нечувствительности данного микроба к антибиотику. Для интерпретации результатов используются специальные таблицы.
Рисунок 1. Определение чувствительности
микроорганизмов диско-диффузионным методом:
1 – микроорганизм чувствителен к антибиотику;
2 – микроорганизм умеренно резистентен к антибиотику;
3 – микроорганизм устойчив к антибиотику.
Метод Е-тестов
Принцип метода. Определение чувствительности микроорганизма проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной. В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).
Рисунок 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов
Метод серийных разведений в бульонной среде
В пробирках, содержащих 1 мл Мюллер-Хинтон бульона, готовят серийные двукратные разведения антибактериального препарата, например 100 мкг/мл – 1-я, 50 мкг/мл – 2-я, 25 мкг/мл – 3-я, 12,5 мкг/мл – 4-я и т.д. Затем в каждую пробирку вносят 0,1 мл испытуемой бактериальной суспензии. Одновременно ставят контроль роста (1 мл Мюллер-Хинтон бульона и 0,1 мл суспензии бактерий). Посевы инкубируют при 37°С в течение 18-24 ч., после чего отмечают результаты. Отсутствие помутнения среды свидетельствует о задержке роста бактерий в присутствии данной концентрации препарата.
Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде
Минимальная подавляющая концентрация (МПК) – наименьшая концентрация антибиотика (в мкг/мл или мг/л), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий.
2 Определение чувствительности разных штаммов стафилококков к антибиотикам методом стандартных дисков
|
Антибиотик |
Зона подавления роста, мм |
Характеристика штамма |
Исследуемая культура является чувствительной к __________________________________________________
умеренно устойчивой к _________________________________________________________________________,
устойчивой к _________________________________________________________________________________.
3 Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) пенициллина методом серийных разведений.
Вывод: МПК пенициллина для исследуемого штамма составляет _____________________________________
Достоинства метода:____________________________________________________________________________
Недостатки метода:____________________________________________________________________________
4 Выявление и регистрация антагонистического действия разных видов бактерий.
На чашку с МПА штрихом по диаметру засевается микроб-антагонист и перпендикулярно к нему тест-штаммы. Учет результатов проводится через сутки после посева. Наличие и степень антагонистического действия определяют по величине зон задержки роста тест-культур.
Штриховой посев________________________
Вывод: наибольшее антагонистическое действие выявлено к тест-штаммам (укажите виды) _____________________________________________________________________________________________
ЗАНЯТИЕ № 8
ТЕМА: ИТОГОВОЕ ЗАНЯТИЕ ПО ТЕМЕ: «ИСТОРИЧЕСКИЕ ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ МИКРОБИОЛОГИИ, МОРФОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ».
Формы и размеры истинных бактерий. Характеристика шарообразных, палочковидных и извитых форм истинных бактерий.
Структура бактерий. Основные отличия прокариотной клетки от эукариот.
Клеточная стенка грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Типы микроскопических препаратов. Техника приготовления фиксированных препаратов.
Техника микроскопии в световом микроскопе. Изучение морфологии микроорганизмов в электронном микроскопе.
Тинкториальные свойства микробов. Красители. Простые способы окраски фиксированных препаратов.
Принципы классификации патогенных прокариот (Берджи, 2001).
Защитные приспособления у микроорганизмов. Споры, стадии и условия образования спор, биологическое значение.
Капсулы бактерий, их значение.
Жгутики, их строение. Реснички. Секс-пили.
Сложные способы окраски. Техника окраски по Граму, Цилю-Нельсену, Бурри-Гинсу, Нейссеру.
Методы исследования микроорганизмов в живом состоянии. КОН-тест. Принцип метода.
Спирохеты. Систематическое положение и морфология спирохет. Особенности ультраструктуры и химического состава. Методы исследования.
Актиномицеты, морфология, ультраструктура, химический состав. Патогенные виды. Роль актиномицетов в природе и медицине. Методы выявления.
Таксономия хламидий. Морфология, структура, способы выявления. Цикл развития хламидий.
Риккетсии, морфология, ультраструктура, химический состав. Патогенные виды.
Микоплазмы. Классификация. Филогенез. Способы выявления.
Дефектные формы микробов: протопласты, сферопласты, L-формы.
Питание бактерий. Питательные вещества – источники углерода и азота. Классификация бактерий по типам питания Аутотрофы и хемоорганотрофы
Факторы роста и их источники. Источники минеральных элементов.
Способы и механизмы переноса питательных веществ через мембрану.
Энергетические потребности бактерий. Пути получения энергии у аутотрофов (фотосинтез, хемосинтез). Источники и пути получения энергии у хемоорганотрофов.
Аэробный и анаэробный типы биологического окисления у бактерий. Аэробные, анаэробные, факультативно анаэробные и микроаэрофильные бактерии. Способы создания анаэробных условий.
Задачи, этапы, преимущества и недостатки бактериологического (культурального) метода исследования.
Рост и размножение микроорганизмов. Способы размножения. Бинарное (простое) деление, механизм. Размножение бактериальных популяций.
Принципы и методы культивирования бактерий. Питательные потребности микробов.
Питательные среды для культивирования бактерий. Требования к питательным средам. Классификация питательных сред.
Условия и техника культивирования бактерий. Техника посева на питательные среды. Закономерности и характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах.
Способы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.
Свойства микроорганизмов, используемые для идентификации выделенных культур.
Ферменты бактерий, классификация. Способы изучения биохимических свойств микроорганизмов. Практическое использование биохимической активности в идентификации бактерий
Определение сахаролитических свойств, состав сред Гисса; определение протеолитических свойств, определение каталазной и оксидазной активности.
Принцип работы и особенности применения приборов автоматической идентификации бактериальных культур (гемокультиватор, автоматический анализатор).
Особенности культивирования риккетсий и хламидий.
Бактериофаги (фаги). История открытия. Морфология, структурные особенности, химический состав и свойства фагов.
Вирулентные фаги. Фазы взаимодействия с бактериальной клеткой. Результаты взаимодействия фага и клетки. Умеренные фаги. Профаг. Явление лизогении. Фаговая конверсия.
Методы выделения и титрования бактериофагов на плотных и жидких питательных средах.Применение фагов в микробиологии и медицине. Фагодиагностика и фаготипирование.
Наследственность. Организация генетического аппарата у бактерий (нуклеоид, плазмиды, Is -последовательности, транспозоны).
Принципы функционирования бактериального генома. Организация оперона. Генотип и фенотип.
Плазмиды, классификация, структура и свойства плазмид. R-плазмида, особенности структуры и функции. Плазмиды бактериоциногении.
Изменчивость микробов. Модификации у бактерий, значение, основные проявления и свойства (ненаследственный характер, адаптивность, высокая частота прямых и обратных изменений, множество индуцирующих факторов).
Генотипическая изменчивость. Мутации и их классификация. Мутагены. Фенотипические проявления мутаций. Судьба мутантов. Диссоциация у бактерий. Влияние отбора. Система репарации повреждений генома.
Рекомбинационная изменчивость. Механизмы образования комбинированных геномов. Частота изменений отдельных признаков. Трансформация, трансдукция, конъюгация.
Практическое значение знаний о генетике микробов. Принципы генетического картирования.
Методы генетического анализа (молекулярная гибридизация, полимеразная цепная реакция, блотинг, секвенирование).
Понятие о генной инженерии и использование ее методов в микробиологии и биотехнологии. Получение и применение генно-инженерных вакцин и цитокинов.
Противомикробные мероприятия. Влияние экологических факторов на микробы. Действие физических факторов (температуры, высушивания, излучений, ультразвука, осмотического давления). Действие химических факторов.
Цели, способы, средства и объекты стерилизации и дезинфекции в медицинской и микробиологической практике. Контроль качества дезинфекции. Контроль стерилизации и стерильности. Способы проведения.
Антисептика. Определение. Антисептические средства, требования, происхождение, свойства, группы, механизмы действия на микробы. Типы антисептики. Терапевтическая антисептика. Профилактическая антисептика.
Химиотерапевтические препараты. Свойства. Основные группы химиопрепаратов. Механизмы действия на бактерии. Понятие об избирательности и "мишенях" действия.
Антибиотики. Определение. Продуценты антибиотиков. Синтетические и полусинтетические антибиотики.
Основные группы антибиотиков по химической структуре. Бета-лактамные антибиотики Тетрациклины. Аминогликозиды. Макролиды и азолиды. Анзамицины (рифампицины). Левомицетин. Фторхинолоновые антибиотики. Линкомицин. Полимиксины. Гликопептиды
Классификация антибиотиков про механизму действия на бактериальную клетку.
Механизмы устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам.
Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам и другим химиопрепаратам. Техника постановки, учета и оценки чувствительности методом дисков, Е-теста, серийных разведений.
ЗАНЯТИЕ № 9
ТЕМА: ЭКОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ. ИНФЕКЦИЯ. ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ. ТОКСИНЫ МИКРОБОВ. БИОЛОГИЧЕСКИЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ) МЕТОД.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
Микрофлора тела человека. Нормальная (резидентная) микрофлора человека. Аутохтонная и аллохтонная, пристеночная и просветная микрофлора. Формирование и развитие нормальной микрофлоры. Функции нормальной микрофлоры: противоинфекционная, метаболическая, иммунобиологическая, антитоксическая.
Дисмикробиоценоз (дисбактериоз), причины, виды, принципы коррекции.
Понятие об инфекции. Определение, общая характеристика. Отличия инфекционных болезней от неинфекционных.
Роль микроорганизма в инфекционном процессе. Инфицирующая доза. Способы заражения. Входные ворота. Патогенность и вирулентность. Генетический контроль патогенности и вирулентности. Факторы, повышающие и снижающие вирулентность микробов.
Факторы патогенности. Методы определения вирулентности, единицы. Облигатно-патогенные и условно-патогенные микроорганизмы.
Токсичность и токсигенность микроорганизмов. Эндотоксины, свойства, получение, применение. Экзотоксины, свойства, получение, единицы измерения. Типы экзотоксинов, механизм действия.
Роль макроорганизма в развитии и течении инфекционных болезней. Наследственные факторы. Анатомо-физиологическое состояние организма. Роль условий жизни в развитии и течении инфекционных болезней. Природные факторы. Социальные факторы.
Классификация инфекционных процессов по тяжести, характеру возбудителя, по источнику инфекции, способу передачи возбудителя и механизму заражения, по распространенности. Классификация инфекционных процессов по локализации микробного очага, длительности течения и кратности заражения.
Динамика инфекционного процесса, его особенности.
Биологический (экспериментальный) метод исследования, этапы, оценка. Лабораторные животные. Способы заражения.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1 Изучения нормальной микрофлоры.
А) Посев для изучения нормальной микрофлоры кожи рук на среду Эндо и кровяной агар методом реплик .
Принцип метода: стерильные кусочки фильтровальной бумаги 1х1 см в чашке Петри увлажнить стерильным физ. раствором. Стерильным пинцетом поместить кусочек бумаги на исследуемую поверхность кожи рук на 0,5 мин. Поместить бумагу на поверхность плотной питательной среды (отпечаток) на 1 мин. Бумагу удалить. Чашки с отпечатками инкубировать при 37 0 С, 24-48 часов.
В) Провести учет посева микрофлоры, приготовить препараты из разных типов колоний, окрасить по Граму, микроскопировать (в демонстрационных посевах).
Учет посева микрофлоры:
Микроскопия препаратов:
|
Препарат______________ _______________________ Окраска _______________ _______________________ |
Препарат______________ _______________________ Окраска _______________ _______________________ |
2 Оценка адгезивности E . coli по их способности к адсорбции на поверхности эритроцитов
Принцип метода: К суспензии эритроцитов добавляют испытуемую культуру микроорганизмов. После инкубации готовят мазки, окрашивают и под микроскопом определяют среднее количество бактерий, адсорбировавшихся на одном эритроците.
Эритроциты в данном случае используются в качестве модели клетки восприимчивого микроорганизма.
3 Определение ферментов инвазивности у стафилококков
1. Плазмокоагулаза
Принцип метода: В пробирку, содержащую цитратную плазму крови кролика, вносится испытуемая культура. После инкубации в термостате учитывается результат. При положительном результате плазма свертывается (коагулирует).
2. Фибринолизин
Принцип метода: В пробирку с фибрином (отмытый от эритроцитов сгусток крови) вносят испытуемую культуру. После инкубации в термостате учитывается результат. При положительном результате сгусток растворяется.
3. Гиалуронидаза
Принцип метода: В пробирку с гиалуроновой кислотой (ГУК) вносят испытуемую культуру. После инкубации в термостате добавляют реактив, вызывающий свертывание ГУК и учитывают результат. При положительном результате (вследствие расщепления ГУК) сгустка не образуется.
4. Лецитовителлаза (лецитиназа)
Принцип метода: выделенные культуры стафилококка засевают на желточно-солевой агар, который содержит 7,5% хлорида натрия и желточную суспензию. При положительном результате вокруг колоний вирулентных стафилококков образуется радужный ореол вследствие расщепления лецитина, содержащегося в желтке куриного яйца.
Вывод: (перечислите ферменты вирулентности каждого из двух изученных штаммов) _____________________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________
Бактериальные токсины
Токсичность __________________________________________________________________________________
Токсигенность _________________________________________________________________________________
Эндотоксин ___________________________________________________________________________________
Эндотоксический шок ___________________________________________________________________________
Практическое применение эндотоксинов:
Экзотоксин ___________________________________________________________________________________
Анатоксин ____________________________________________________________________________________
Схема получения экзотоксина и анатоксина.
1.____________________________________________________________________________________________
2.____________________________________________________________________________________________
4.____________________________________________________________________________________________
Практическое применение анатоксинов:
1.____________________________________________________________________________________________
2.____________________________________________________________________________________________
3.____________________________________________________________________________________________
